ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) - в настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом электрофореза уверенно пришли флуоресцентные методы детекции продуктов амплификации. Получать и интерпретировать результаты ПЦР становится проще, быстрее и надежнее.Применение этого метода анализа исключает стадию электрофореза. Это дает возможность предотвратить ложноположительные результаты и существенно сократить время для получения результата. ПЦР в реальном времени дает возможность исследовать материал за 20-60 минут и обнаружить даже одну молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты в пробе.
Полимеразный метод цепной реакции создал Кэри Мюллис в 1983 г. За свое изобретение, ставшее одним из самых выдающихся в конце 20 века в сфере молекулярной биологии, он удостоился Нобелевской премии по химии (1993).Принцип анализа методом Real-Time PCR
базируется на выявлении в биоматериале малой части ДНК провокатора подозреваемой инфекции. Дезоксирибонуклеиновая кислота состоит из множества оснований, поэтому для распознавания заболевания хватит минимального фрагмента молекулы. В период проведения ПЦР-анализа выискивается такой элемент ДНК, который характерен только для конкретного возбудителя инфекции.
Одним из флуоресцентных методов как раз и является метод ПЦР в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.
1. В состав реакционной смеси наряду с праймерами и остальными компонентами реакции добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя. На 3’-конце зонда находится флуоресцентная молекула – флуорофор, а на 5’-конце расположена молекула-“гаситель” флуоресценции. За счет близости флуорофора и “гасителя” вся энергия, поглощенная флуорофором, переходит на “гаситель” по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии. При этом сигнал флуоресценции отсутствует.
2. В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК возбудителя, и зонд наряду с праймерами гибридизуется с комплементарным участком ДНК.
3. В процессе синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимераза расщепляет этот зонд. При расщеплении зонда флуорофор отделяется от “гасителя”, расстояние между ними увеличивается, процесс тушения флуоресценции становится невозможным. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флуорофора.
В результате такого принципа неспецифическая амплификация не обнаруживается.
ПЦР “в реальном времени” имеет ряд значительных преимуществ:
-существенное снижение риска контаминации и ошибок при анализе результатов;
-высокая специфичность реакции за счет использования высокоспецифичных флуоресцентных зондов;
-высокая достоверность анализа;
-определение численности фрагментов ДНК в материале;
-минимальный риск получения ошибочного результата при диагностике;
-короткий срок осуществления ПЦР анализа;
-возможность обнаружения нескольких возбудителей одновременно;
-фиксация процедуры и результатов в электронном виде.
ПЦР “в реальном времени” характеризуется возможностью проведения
качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице.
Данный метод используется в медицинской практике для определения вирусной, бактериальной нагрузки (количества агентов), для установления числа внутриклеточных возбудителей инфекций, для анализа результативности лечения, для выявления устойчивости к лекарственным препаратам.
Заболевания, которые можно выявить с помощью ПЦР:
-ВИЧ-инфекция;
-инфекции, которые передаются половым путем;
-вирусные гепатиты;
-папилломавирус человека;
-мононуклеоз;
-цитомегаловирусная инфекция;
-герпес;
-туберкулез;
-клещевой энцефалит;
-кандидоз;
-хеликобактерная инфекция и другие.
Материал для сдачи ПЦР-анализа:
-соскоб клеток эпителия (из уретры у мужчин, из половых путей у женщин);
-кровь и ее компоненты;
-жидкости (плевры, суставов и др.);
-слизь;
-слюна;
-моча;
-эякулят.
Подробно и познавательно о методах ПЦР: На сегодняшний день полимеразная цепная реакция в реальном времени — одно из самых безошибочных исследований. Но при подозрении на любое заболевание не обязательно прибегать только к этому виду исследования. Есть определенная группа инфекций, для которых предпочтительны другие методы.
Статистика: Добавлено Cesare — Сегодня, 04:12
NASBA-тест (от англ. Nucleic acid sequence based amplification) – это современная методика диагностирования и наблюдения за терапией разнообразных заболеваний, которые передаются половым путем , и некоторых других вирусных заболеваний.
Основу методики составляет амплификация молекул рибонуклеиновой кислоты (РНК) возбудителей заболеваний, при участии ферментов обратной транскриптазы, РНК-полимеразы и РНК-азы, в отличие от ПЦР-диагностики (Полимеразной Цепной Реакции), при осуществлении которой обнаруживается ДНК. NASBA-тест был разработан Дж. Комптоном в 1991 году. Сразу после изобретения NASBA, последний был использован для быстрой диагностики и количественного определения ВИЧ-инфекции в сыворотке крови пациента.
Особенности и преимущества:
При помощи
NASBA-теста можно обнаружить лишь живые клетки, в которых синтезируется рибонуклеиновая кислота в процессе их жизнедеятельности. В противоположность РНК, молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) довольно стабильна и не разрушается после гибели микроорганизмов, поэтому анализ (ПЦР-диагностика) может иметь положительный результат в связи с существованием мертвых клеткок агента и даже их разрушенных элементов. А РНК разнится от ДНК тем, что она очень нестабильна, после гибели возбудителя довольно быстро разрушается, в связи с чем ее определение становится невозможным. Это имеет особенную актуальность после проведения терапии или при существовании сомнений. К примеру, если ПЦР-диагностика совершается не ранее, чем через
три-четыре недели после окончания лечения, то NASBA-тест берется
через пять-семь дней. Хотя молекулы РНК могут быть также амплифицированы с помощью ПЦР-диагностики с использованием обратной транскриптазы (в целях синтеза комплементарной цепи ДНК в качестве матрицы), основным преимуществом NASBA-теста является то, что он осуществляется в изотермических условиях - обычно при постоянной температуре 41 °С.
Тест имеет отличительную особенность – очень высокую чувствительность. Всего на одной цепочке дезоксирибонуклеиновой кислоты синтезируется большое количество РНК-молекул, которые в последующем принимают участие в биосинтезе белков в клетках. В связи с этим, число молекул РНК многократно превышает количество ДНК, что существенно облегчает их обнаружение. Это позволяет диагностировать болезнь на самых начальных стадиях, а также в случае вялотекущих хронических реакций, когда не существует выраженных клинических симптомов. Обнаружение в режиме реального времени продуктов амплификации (NASBA-Real-time) с помощью флуоресцентных зондов еще больше увеличивает специфичность методики и объективный характер результатов диагностики.
Материал для проведения NASBA-теста может быть следующим:
-соскоб клеток цервикального канала;
-соскоб клеток уретры;
-сперма;
-моча;
-кровь.
NASBA-тест широко применяется с целью диагностирования и контроля за лечением и его эффективностью следующих половых инфекций:
-трихомониаз;
-гонорея;
-хламидиоз;
-микоплазмоз;
-ВИЧ и СПИД.
Кроме всего прочего,данный метод диагностики позволяет оценить эффективность лечения антибактериальными препаратами уже на 8-10 день их приема.
Детекция продуктов амплификации в режиме реального времени (NASBA-Real-time) с использованием флуоресцентных зондов дополнительно увеличивает специфичность теста и объективность результатов лабораторного исследования.
Статистика: Добавлено Cesare — Сегодня, 03:41
Очень распространенная в гинекологии инфекция половых органов у дам — молочница, хламидиоз, микоплазмоз, генитальный герпес, уреаплазмоз. Чтобы вовремя защитить свой организм от вышеперечисленных гинекологических заболеваний, исключить появление
Читать дальше
