Главный медицинский форум! Голосов: 0 Адрес блога: https://simptom.club/forum/index.php Добавлен: 2016-12-03 17:02:07

Диагностика ИППП и ЗППП • ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)

2016-12-03 05:12:11 (читать в оригинале)

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) - в настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом электрофореза уверенно пришли флуоресцентные методы детекции продуктов амплификации. Получать и интерпретировать результаты ПЦР становится проще, быстрее и надежнее.Применение этого метода анализа исключает стадию электрофореза. Это дает возможность предотвратить ложноположительные результаты и существенно сократить время для получения результата. ПЦР в реальном времени дает возможность исследовать материал за 20-60 минут и обнаружить даже одну молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты в пробе.
Полимеразный метод цепной реакции создал Кэри Мюллис в 1983 г. За свое изобретение, ставшее одним из самых выдающихся в конце 20 века в сфере молекулярной биологии, он удостоился Нобелевской премии по химии (1993).Принцип анализа методом Real-Time PCR
базируется на выявлении в биоматериале малой части ДНК провокатора подозреваемой инфекции. Дезоксирибонуклеиновая кислота состоит из множества оснований, поэтому для распознавания заболевания хватит минимального фрагмента молекулы. В период проведения ПЦР-анализа выискивается такой элемент ДНК, который характерен только для конкретного возбудителя инфекции.
Одним из флуоресцентных методов как раз и является метод ПЦР в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.
1. В состав реакционной смеси наряду с праймерами и остальными компонентами реакции добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя. На 3’-конце зонда находится флуоресцентная молекула – флуорофор, а на 5’-конце расположена молекула-“гаситель” флуоресценции. За счет близости флуорофора и “гасителя” вся энергия, поглощенная флуорофором, переходит на “гаситель” по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии. При этом сигнал флуоресценции отсутствует.
2. В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК возбудителя, и зонд наряду с праймерами гибридизуется с комплементарным участком ДНК.
3. В процессе синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимераза расщепляет этот зонд. При расщеплении зонда флуорофор отделяется от “гасителя”, расстояние между ними увеличивается, процесс тушения флуоресценции становится невозможным. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флуорофора.
В результате такого принципа неспецифическая амплификация не обнаруживается.

ПЦР “в реальном времени” имеет ряд значительных преимуществ:

-существенное снижение риска контаминации и ошибок при анализе результатов;
-высокая специфичность реакции за счет использования высокоспецифичных флуоресцентных зондов;
-высокая достоверность анализа;
-определение численности фрагментов ДНК в материале;
-минимальный риск получения ошибочного результата при диагностике;
-короткий срок осуществления ПЦР анализа;
-возможность обнаружения нескольких возбудителей одновременно;
-фиксация процедуры и результатов в электронном виде.

ПЦР “в реальном времени” характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице.
Данный метод используется в медицинской практике для определения вирусной, бактериальной нагрузки (количества агентов), для установления числа внутриклеточных возбудителей инфекций, для анализа результативности лечения, для выявления устойчивости к лекарственным препаратам.

Заболевания, которые можно выявить с помощью ПЦР:

-ВИЧ-инфекция;
-инфекции, которые передаются половым путем;
-вирусные гепатиты;
-папилломавирус человека;
-мононуклеоз;
-цитомегаловирусная инфекция;
-герпес;
-туберкулез;
-клещевой энцефалит;
-кандидоз;
-хеликобактерная инфекция и другие.

Материал для сдачи ПЦР-анализа:

-соскоб клеток эпителия (из уретры у мужчин, из половых путей у женщин);
-кровь и ее компоненты;
-жидкости (плевры, суставов и др.);
-слизь;
-слюна;
-моча;
-эякулят.

Подробно и познавательно о методах ПЦР:


На сегодняшний день полимеразная цепная реакция в реальном времени — одно из самых безошибочных исследований. Но при подозрении на любое заболевание не обязательно прибегать только к этому виду исследования. Есть определенная группа инфекций, для которых предпочтительны другие методы.

Статистика: Добавлено Cesare — Сегодня, 04:12